chromatographie
Technique d'analyse chimique utilisée pour séparer les constituants d'un mélange.
1. Principe de la chromatographie
Le principe de la chromatographie est basé sur les différences d’affinité des composés d’un mélange entre une phase mobile et une phase fixe. De manière plus précise, les différents constituants du mélange sont entraînés par la phase mobile et sont séparés graduellement sur la phase fixe (ou stationnaire) en fonction de leur adsorption ou de leur solubilité (→ solution), selon la technique chromatographique utilisée.
La phase mobile peut être soit un liquide (elle est alors appelée éluant), soit un gaz (elle est alors appelée gaz vecteur).
La phase fixe quant à elle peut être solide (gel de silice, alumine, etc.) ou liquide.
Chaque constituant du mélange étudié a une vitesse de migration caractéristique qui permet de le séparer des autres et ainsi de l’identifier. De manière générale, l'échantillon est analysé par comparaison avec des substances déjà connues dans l'échantillon. Le diagramme obtenu par chromatographie est appelé chromatogramme et traduit la variation du composé étudié (espèce minoritaire) dans la phase mobile (éluant ou gaz vecteur) en fonction du temps.
2. Les différents types de chromatographie
On peut classer globalement les différentes techniques chromatographiques en deux grandes familles : les chromatographies en phase liquide et les chromatographies en phase gazeuse.
2.1. Chromatographies en phase liquide (CPL)
Il existe différents types de chromatographies en phase liquide suivant la méthode de séparation utilisée.
Chromatographie par adsorption
L'appareillage est constitué d'une colonne chromatographique (en verre ou en acier inoxydable), remplie de particules solides de diamètre inférieur à 20 µm (généralement de l'alumine ou du gel de silice). Quelques microlitres de la solution à analyser sont introduits en tête de colonne. Les constituants séparés en sortie de colonne sont détectés par spectroscopie UV ou par réfractométrie.
Comme son nom l'indique, cette chromatographie est fondée sur l'adsorption sélective des constituants liquides sur la phase solide de la colonne. En fait, il se produit une succession d'adsorptions et de désorptions, ces dernières étant provoquées par l'ajout d'un solvant en fin de séparation.
Chromatographie de partage liquide-liquide
Cette technique chromatographique utilise la différence de solubilité (→ solution) des constituants vis-à-vis de deux liquides non miscibles.
Chromatographie d’exclusion ou par perméation de gel (GPC)
La chromatographie d’exclusion utilise la différence de pénétration des constituants sur un gel de polymère. Lors de leur traversée de la colonne, seules les molécules dont le diamètre est inférieur à une certaine valeur peuvent pénétrer dans les pores du gel. Les composés sont ainsi séparés selon la taille de leurs molécules.
Chromatographie par échange d'ions
Cette technique chromatographique utilise l'échange d'ions entre la phase fixe (résine constituée d'ions) et la phase mobile préalablement ionisée. Les ions sont en général des acides, des bases ou des cations métalliques. La chromatographie par échange d'ions est employée pour des substances ionisables, en particulier en chimie minérale.
Chromatographie sur papier
En chromatographie sur papier, le mélange à analyser est préalablement mis en solution. On dépose une goutte de ce mélange liquide sur une feuille de papier. Le solvant migre par capillarité, entraînant avec lui les différents constituants du mélange, qui s'arrêtent plus ou moins loin de la tache formée par la goutte initiale selon leur interaction avec la cellulose du papier.
Chromatographie sur couche mince (CCM)
La chromatographie sur couche mince, étudiée au lycée, est très semblable à la chromatographie sur papier, la phase fixe étant une fine couche d'adsorbant (généralement de silice) déposée sur une plaque de verre. Le mélange à étudier est déposé à l’aide d’un capillaire à environ un centimètre du bord, puis placé dans une cuve contenant l’éluant. L’éluant migre sur la plaque de silice par capillarité et entraîne les composés du mélange étudié, qui seront séparés s’ils possèdent des vitesses de migration différentes. La plaque de chromatographie est ensuite lue directement si les composés sont visibles, ou placé sous une lumière ultraviolette (UV).
Le principal intérêt de la CCM est l’identification rapide des composés d'un mélange, mais cette technique ne permet pas le dosage d'un composé.
Chromatographie liquide à haute pression/performance (HPLC)
La chromatographie en phase liquide à haute pression (également appelée chromatographie en phase liquide à haute performance) remplace de plus en plus la chromatographie liquide sur colonne par simple percolation à pression atmosphérique, du fait de sa faible vitesse d’élution. En effet, la technique HPLC permet d’employer des phases stationnaires de granulométrie bien plus fine (de 3 à 10 µm) mais qui nécessitent une pression d’entrée de colonne pouvant aller jusque 400 bars environ.
Cette technique est ainsi devenue l'une des techniques les plus employées dans les laboratoires d'analyse chimique du fait de son extrême précision permettant la recherche de composés à l’état de traces. Couplée à une méthode de détection adéquate (un spectromètre de masse, par exemple), cette chromatographie à débit imposé permet l'identification et la quantification d’une grande variété de composés organiques ou inorganiques.
2.2. Chromatographies en phase gazeuse (CPG)
La chromatographie en phase gazeuse permet de séparer des mélanges de gaz ou de composés vaporisables à haute température. Le mélange à analyser est injecté dans une colonne métallique de quelques millimètres de diamètre contenant la phase fixe. Les composés sont véhiculés sous pression par un gaz (dit gaz vecteur). Il s'agit généralement de l'hélium (He), de l'argon (Ar) ou de l’azote (N2).
Le temps que met un constituant gazeux pour parcourir la colonne est son temps de rétention, qui est caractéristique du composé. Les constituants sont ainsi séparés par la différence entre leurs temps de rétention respectifs.
Le choix de la phase fixe est déterminant pour la réussite de la séparation. Cette phase est choisie selon sa porosité et ses interactions avec la phase mobile, qui dépendent en particulier de la différence de polarité entre les deux phases.
La chromatographie en phase gazeuse est un moyen de séparation très efficace. Elle est notamment utilisée dans les raffineries et dans l'industrie chimique. On peut la coupler avec un spectromètre de masse pour identifier les composés du mélange vaporisé au fur et à mesure de leur élution.
3. Historique et applications des chromatographies
La chromatographie a été inventée en 1906 par le botaniste russe Mikhaïl Tsvet, qui cherchait à séparer des pigments végétaux. Il avait notamment constaté la séparation des constituants colorés de la chlorophylle brute (qui contient des chlorophylles a et b, des carotènes et de la xanthophylle → caroténoïde) lorsque sa solution montait le long d'un papier filtre. Les différents constituants formaient en effet des bandes de couleurs distinctes à des hauteurs différentes. Mais il a fallu attendre les années 1930 pour que la chromatographie soit utilisée plus largement dans différents domaines.
Aujourd’hui, les techniques chromatographiques sont omniprésentes dans de très nombreux secteurs d’activités. Elles font partie des techniques incontournables utilisées aussi bien dans les laboratoires de recherche (chimie, biochimie, médecine, toxicologie, répression des fraudes…) que dans les industries chimique, parachimique (cosmétiques, produits phytosanitaires, parfums, polymères…) et pharmaceutique. Cette généralisation de l’utilisation de la chromatographie est liée d’une part à des raisons économiques (son coût relativement faible) et d’autre part à ses avantages indéniables : vitesse d'exécution et analyse qualitative et quantitative de faibles quantités d'échantillon.